CIB2，VCAN及下游靶基因在非小细胞肺癌耐药综合治疗及耐药性检测中的应用

cib2，vcan及下游靶基因在非小细胞肺癌耐药综合治疗及耐药性检测中的应用

1.本发明属于生物制药及非小细胞肺癌对吉非替尼耐药性综合治疗和耐药性检测应用技术领域，具体涉及一种cib2、vcan及下游靶基因rac1、n- 和在恶性肿瘤治疗耐药综合治疗及耐药性检测中的应用。

背景技术：

2.恶性肿瘤是我国攻关的重点疾病之一。肿瘤治疗过程中的一大缺点是肿瘤细胞对常规抗癌化疗药产生原发或诱发性的耐药性，导致临床化疗失败。肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞型肺癌(non small cell lung ,nsclc)包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低，所以，为肺癌患者寻找新的治疗方法非常重要。

3.吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tkis)，其作用机制有：竞争表皮生长因子受体酪氨酸激酶催化区域上的mg-atp结合位点，阻断其信号传递；抑制肿瘤血管生成；抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，促进细胞凋亡。目前在临床实验中已证实吉非替尼对局部晚期非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌等具有抗肿瘤效应并可改善疾病相关症状：适用于治疗接受过化疗或不适于化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(nsclc)。然而，即使是治疗有效者，多数也会在治疗后6～12个月发生不同程度的耐药现象。最终将导致肿瘤进展，药物的疗效降低，所以研究其耐药机制尤为重要。目前发现，吉非替尼的耐药机制可能与以下几方面有关：egfr基因的二次突变和c-met的扩增、激活il-6/jak1/stat3信号通路、激活pi3k/akt信号通路、激活igf1r介导的信号通路、kras突变等等。但是仍有30％左右的患者产生egfr-tkis获得性耐药的机制尚不清楚。因此探索除egfr突变状态外的其它tkis耐药机制，延迟甚至逆转肺癌细胞对吉非替尼的耐药显得尤为重要。

4.钙和整合素结合蛋白(cib)家族由四个ef手性钙离子结合蛋白组成，命名为 cib1-4(1)。其中，cib1被报道与癌症的凋亡有关。而对cib的另一个家族成员cib2研究较少，cib1的氨基酸序列高度相似，并可能共享一个相似的疏水靶标结合口袋。基于cib1和cib2之间的序列和假定的结构相似性，可以探讨cib2 对癌症影响。vcan是聚集蛋白聚糖/蛋白聚糖家族的成员。编码的蛋白质是大的硫酸软骨素蛋白聚糖，是细胞外基质的主要成分。该蛋白参与细胞粘附，增殖，增殖，迁移和血管生成，并在组织形态发生和维持中起关键作用。rac1 编码的蛋白是一种gtp酶，属于小分子gtp结合蛋白的ras超家族，这个超家族的成员似乎调控着一系列不同的细胞事件，包括控制细胞生长、细胞骨架重组和蛋白激酶的激活。已发现该基因有两种转录变异体，编码不同的异构体,它是调控egfr下游信号通路的重要信号分子，并有报道与肿瘤的侵袭与转移有关。我们发现cib2可以通过激活rac1进而促进上皮间质转移进而增加吉非替尼对非小细胞肺癌的耐药性。提示cib2为非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药提供了新方向。

技术实现要素：

5.为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种cib2， vcan及其下游调控分子rac1、n-和在制备综合逆转吉非替尼耐药性药物，一种综合检测肿瘤发生和耐药性产生的检测试剂盒的应用。本发明目的通过以下技术方案实现：

6.cib2及vcan在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药性药物以及检测试剂盒中的应用。所述的逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药性药物包含靶向cib2 及vcan药物、载体和助剂。上述逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药性药物可制备成片剂、颗粒、胶囊、口服液或注射液。所述的肿瘤耐药性检测cib2及 vcan以及下通路rac1/emt的检测试剂或检测试剂盒。

7.上述逆转肿瘤耐药性药物还包括载体和助剂。

8.所述载体包括选自乳糖、淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和水中的一种或两种以上。

9.所述的助剂包括蹦解剂、抗黏剂、润滑剂、黏合剂和助溶剂中的一种或两种以上。

10.所述的崩解剂优选淀粉或微晶纤维素；抗黏剂和润滑剂优选滑石粉、胶体硅胶、硬脂酸甘油酯、硬脂酸钙或镁粉；助溶剂优选甲磺酸、富马酸、山梨醇单月。

11.所述的vcan序列为5

’‑

c-3’12.所述的cib2序列5

’‑

ga-3’13.所述的rac1序列为5

’‑

ga-3’。

14.上述cib2及vcan和rac1序列应用包括制备成用于克服和逆转肺癌耐药的片剂、颗粒、胶囊、口服液或注射液的药物。

15.上述cib2及vcan和rac1序列应用包括制备成用于检测肺癌病人耐药的检测试剂以及检测试剂盒。

16.本发明的应用具有如下优点及有益效果：

17.cib2及vcan通过激活rac1、n-和增加非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药性。预示着，cib2和vcan以及其下游分子rac1、n- 和可以作为一种非小细胞肺癌对吉非替尼耐药的标志基因，来为非小细胞肺癌对吉非替尼耐药性的综合治疗和综合检测提供理论依据。

附图说明

18.图1为cib2及vcan在人肺癌组织中表达上调。

19.图2为cib2在吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中表达上调。

20.图3为cib2促进吉非替尼耐药对非小细胞肺癌细胞耐药性。

21.图4为cib2敲除后下游蛋白表达水平变化情况。

具体实施方式

22.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中末注明具体条件的实验方法，基本上都按照，j 等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

23.实施例1：

24.通过慢病毒包装，再经过嘌呤霉素的筛选的方法构建稳定过表达cib2的 pc-9非小细胞肺癌细胞系。再通过qrt-pcr和 的方法检测稳定细胞株pc-9/pcdh、pc-9/cib2和pc-9g/v2、pc-9g/中cib2的表达水平，经过三次验证后确保稳定表达细胞株构建完成。验证成功后，进行细胞药物敏感检测实验。将稳定表达的pc-9/pcdh、pc-9/cib2和pc-9g/v2、 pc-9g/细胞系分别种植与96孔板上，第二天加吉非替尼处理，72小时后使用cck-8试剂盒并按照说明进行实验。每2小时放入多功能酶标仪进行检测，观察其od450的吸光值。发现过表达的cib2的pc-9细胞系对吉非替尼耐药性增加，敲除cib2的pc-9g细胞系对吉非替尼的敏感性增加，并有统计学意义。将稳定细胞株pc-9/pcdh、pc-9/cib2和pc-9g/v2、pc-9g/细胞系消化适度，种入预先准备的小室中，再将小室放入24孔板中，在24孔板下层预先加入适量的有血清培养基促使细胞发生迁移。经过18-24 小时的细胞迁移时间，将小室取出用结晶紫甲醇混合液进行染色。10-15分钟后，结束染色，用pbs进行洗涤，置于显微镜下观察拍照。每个样品做三个副孔，重复试验确保数据可靠。将拍完照的小室取出，用33％的醋酸洗涤，并检测其吸光度绘制成表。通过小室实验，我们发现cib2促进pc-9 细胞系的迁移侵袭能力。

25.实施例2：

26.通过生物信息学软件和网站预测cib2的下游通路，发现cib2可以激活 rac1是,并通过 实验在pc-9/pcdh、pc-9/cib2和pc-9g/v2、 pc-9g/稳定表达细胞系检测cib2在非小细胞肺癌中蛋白水平，以及下游信号通路相关蛋白的影响。

27.我们发现，在过表达cib2的pc-9细胞系中rac1、n-和的蛋白水平升高，而e-的蛋白水平降低。在敲除cib2的pc-9g细胞系中 rac1、n-和的蛋白水平降低，而e-的蛋白水平升高。

28.实施例3：

29.我们通过数据库和kegg通路富集分析得出rac1是cib2的潜在下游靶基因，通过数据库和-meier分析得出在nsclc中rac1 与cib2相同都是一个促癌因子，应用 blot验证cib2对rac1的表达影响并探索具体耐药机制，结果显示在cib2过表达肺癌细胞中rac1表达上调，同时发现与emt相关的标志物e-表达下调，n-和表达上调，提示促进了emt转化。